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青島能源所開發出二代拉曼激活細胞彈射耦合測序技術

2020-06-04 青島生物能源與過程研究所
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  拉曼激活细胞弹射耦合测序(RACE-Seq)是微生物组单细胞分析的手段之一,但其基因组覆盖度通常不超过10%,而且核酸扩增成功率低,极大限制了其应用。中國科學院青島生物能源與過程研究所单细胞中心系统评估和优化了该技术,并改进了单细胞基因组扩增环节,从而提高了RACE-Seq的基因组覆盖度和核酸扩增成功率(图1)。该工作近日发表于Analytical Chemistry

  作爲微生物在自然界中的存在形式,微生物組(菌群;Microbiome)與人體和自然界的過去、現在和未來息息相關。但是,菌群中絕大部分微生物組分通常難以快速培養和利用,因此,微生物組又被稱爲“生命暗物質”。如何識別和利用“生命暗物質”中的功能組分,一直是生命科學和環境科學中的一個共性方法學問題。

  針對這個瓶頸,單細胞中心和業界同行前期發明了一系列單細胞拉曼分選技術與裝備(RACS-Seq; Biotechnol Adv, 2019; doi: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010)。RACS-Seq技术家族的工作原理均为,基于单细胞拉曼光谱来从菌群样品中直接识别和分选特定代谢功能的细胞,进而与核酸提取、扩增和测序对接,从而深刻理解菌群中“谁在做什么?如何做?”。其中的RACE-Seq技术将菌群细胞风干后、在弹射芯片表面平铺成单层,逐一采集拉曼光谱后,采用另一束激光将目标拉曼光谱的细胞从芯片表面弹射到接收芯片的小孔中,进而在小孔中进行核酸扩增和测序文库制备。但是,在已发表的RACE-Seq应用于人体或菌群分析的工作中,单细胞基因组测序的覆盖度普遍很低(很少超过20%,大多在10%以下),同时其完整流程的成功率也不高,以致于通常需要把几个乃至几十个细胞弹射至同一个小孔中,混合进行基因组扩增和测序,以提高实验的成功率。这种低覆盖度而且混合测定的单细胞基因组数据,从根本上阻碍了在细胞“个体”水平的基因组结构分析与代谢功能重建。

  爲了揭示RACE-Seq基因組覆蓋率極低的原因,單細胞中心蘇曉璐與公衍海帶領的研究小組,基于長期努力,從實驗操作和數據計算分析兩個角度入手,建立了系統性的RACE-Seq方法和芯片的質量評估和控制體系。在此基礎上,全面、定量地評估了細胞裂解條件、核酸擴增條件和拉曼測量條件等每一環節的關鍵參數對RACE-Seq基因組測序質量的影響。結果發現,激光照射強度在拉曼信號采集過程中至關重要,並與單細胞核酸擴增(MDA)的成功率成反比。

  針對這些問題,研究人員開發出了二代RACE-Seq(圖1):在單細胞擴增體系中加入特定油相並充分震蕩,産生大量隨機包裹的微體積液滴,造成每個DNA片段在破乳前均達到飽和擴增,從而大幅提高RACE-Seq中單細胞基因組的覆蓋度。這種操作方法簡單快速,而且容易實現自動化。

  与第一代RACE-Seq相比,该二代技术可将纯培养大肠杆菌(每个MDA体系含5个弹射出的细胞)单细胞基因组覆盖度从 < 20% 提高到50%。针对土壤菌群样品的测试表明(每个MDA体系含2~5个弹射出的细胞),二代技术可将MDA反应的成功率从58%提高到 90%,而将MDA产物16S扩增成功率从0%大幅提升至83%。基于这些优点,单细胞中心开发了RACE-Seq试剂盒(图2),以服务于各种环境样品和应用场景。

  盡管如此,由于拉曼全譜采集對于細胞活性的破壞,RACE-Seq目前還難以實現在“一個”細菌細胞水平的高覆蓋度基因組測序或細胞培養。針對這些局限性,研究人員正在開發一系列液相拉曼分選耦合測序器件,以建立與完善一個高拉曼全譜信號質量、高基因組測序覆蓋度、高效保護細胞活性、一個細菌細胞精度的微生物組分析技術服務體系。

  苏晓璐和公衍海是論文的共同第一作者。该工作得到中科院先导B项目、青岛海洋科学与技术试点国家实验室、国家自然科学基金等的支持。

  論文信息:

  1. Xiaolu Su, Yanhai Gong, Honglei Gou, Xiaoyan Jing, Teng Xu, Xiaoshan Zheng, Rongze Chen, Yuandong Li, Yuetong Ji, Bo Ma, Jian Xu. Rational Optimization of Raman-Activated Cell Ejection and Sequencing for Bacteria. Anal Chem, 2020 May 29. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05345.

  2. Yuehui He, Xixian Wang, Bo Ma, Jian Xu, Ramanome Technology Platform for Label-free Screening and Sorting of Microbial Cell Factories at Single-cell Resolution. Biotechnol Adv, 2019 May 29. pii: S0734-9750(19)30069-2. doi: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010.

图1. 二代RACE-Seq技术的总体示意图

图2. 针对二代RACE-Seq设计的菌群单细胞拉曼弹射耦合核酸扩增试剂盒

打印 責任編輯:葉瑞優

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