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上海巴斯德所等利用RNA編輯策略實現對逆轉錄轉座子的編輯幹預

2020-05-22 上海巴斯德研究所
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  519日,Cell Discovery 在线发表了中國科學院上海巴斯德研究所研究员郝沛利用RNA编辑策略、编辑干预逆转录转座子的合作研究論文:Interfering with retrotransposition by two types of CRISPR effectors: Cas12a and Cas13a。該研究利用逆轉錄病毒/逆轉錄轉座子生命周期中具有DNARNA兩個不同階段的特性,首次采用RNA編輯的策略,實現了對逆轉錄轉座子Tf1(類似于逆轉錄病毒的模式生物)的編輯幹預。同時,該工作還第一次采用CRISPR-Cas12a對逆轉錄病原體的DNA階段進行編輯,達到了100%的編輯幹預效率。

   該研究開拓了對逆轉錄病原體(包括外源的逆轉錄病毒、內源性逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子)進行編輯幹預的新思路。爲RNA編輯和DNA編輯技術應用于逆轉錄病毒感染阻斷、器官移植中的內源逆轉錄病毒失活和種質資源培育中的逆轉錄轉座子抑制,提供了新的技術策略和並建立了系統參數。

  近年來,CRISPR系統開始發展成爲對抗逆轉錄病原體(包括外源的逆轉錄病毒、內源性逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子)非常有前途的重要技術。外源和內源性的逆轉錄病毒是引發人體疾病的嚴重起因,也是器官移植(同種和異種器官移植術)中重大的風險因素。導致疾病的著名外源和內源性逆轉錄病毒包括HIV-1、HTLV-1、HERV-K等。前期科學家嘗試用CRISPR-Cas9編輯消除病人體內的HIV-1,抑制作爲器官移植供體的豬體內內源性逆轉錄病毒(ERVs),和消除水稻育種中逆轉錄轉座子Tos17的幹擾,取得了一定的進展。

  雖然近年來發現的、專門靶向編輯RNA CRISPRVI亞型 Cas13,为對逆轉錄病原體的编辑干预,提供了新的可能性和技术策略。由于逆转录病毒/逆轉錄轉座子生命周期中具有DNARNA兩個不同階段的特性,理論上RNA編輯的方法可以通過編輯RNA中間體,有效幹預和對抗逆轉錄病原體,但這一技術策略迄今爲止尚沒有被探索過。另外,近年來發現與CRISPR-Cas9類似、作用于DNACRISPRV亞型Cas12a,具有一些優秀特性,包括對PAM區的不同要求、自處理産生crRNA的能力和更高的靶向效率。但到目前爲止尚沒有Cas12a應用于編輯幹預逆轉錄病原體的報道。本研究在以下幾個方面取得了新的進展:

  構建了Tf1逆轉錄轉座的報告系統。爲了應用RNA編輯(利用Cas13a)的技術策略和Cas12對逆转录病原体编辑干预,郝沛课题组与合作者首先構建了Tf1逆轉錄轉座的報告系統。他們在Tf1NEO基因中引入了反向的內含子(構建多達4種不同的內含子序列),這樣Tf1轉錄剪接後新形成的Tf1産物將不具有這些引入的內含子。然後通過設計crRNA,在實驗中特異性靶向這些新形成的不包含內含子的Tf1産物。

  首次證明RNA編輯顯著幹預抑制Tf1逆轉錄轉座活性。郝沛課題組與合作者設計了Cas13靶向Tf1中間轉錄本的兩個特異位點和隨機對照的實驗,獲得了對Tf1轉座活性的16%60%的顯著編輯抑制效果。這些結果第一次證明了RNA編輯是對逆轉錄病原體有效的幹預策略更進一步,對比Cas13a與靶標結合被激活後(由于其亂切割活性)導致原核宿主細胞生長停滯的現象,研究者沒有觀察到Tf1在真核宿主中激活導致細胞停止生長的現象。這暗示了RNA編輯技術在真核宿主的安全性,也表明Cas13a在真核細胞與細菌細胞中的作用機制有所不同。

  第一次采用CRISPR-Cas12a實現對逆轉錄病原體DNA階段進行編輯幹預。通過設計Cas12a靶向Tf1逆轉錄本的多個特異位點(5crRNA設計)和隨機對照的實驗,發現Cas12aTf1逆轉錄轉座的顯著編輯抑制作用(達到90%——雖然仍有殘余的Tf1轉座發生。研究者猜測殘余的轉座活性,是由于Tf1中間産物被VLP包装保护的结果。 所以更进一步,通过延长crRNA的表達時間,最終完全消除了殘余轉座活性,達到了100%的編輯幹預效率

  这些研究成果,开拓了對逆转录病毒/逆轉錄轉座子進行編輯幹預的新思路和新方法。比較了RNA編輯和DNA编辑的不同作用机制,完成了两类机制對逆转录病原体复制和转座的编辑干预效果的定量分析,为新技术策略发展建立了基础并提供了系统参数。

  該項研究工作由中科院上海巴斯德所研究員郝沛與中科院分子植物卓越創新中心合成生物學重點實驗室研究員李軒、美國密歇根大學教授王紅兵(Hongbing Wang)合作完成。張牛冰和荊新雲爲共同第一作者。相關工作得到國家重點研發計劃、中科院戰略先導項目和自然科學基金項目的支持。

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打印 責任編輯:葉瑞優

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